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秀丽隐杆线虫是重要的模式生物，是研究多细胞真核生物细胞和分子生物学的材料。秀丽隐杆线虫有6对染色体，每条染色体都有端粒，其序列为TTAGGC，跟哺乳动物的端粒TTAGGG非常相似，其长度由端粒酶维持。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol，端粒重复片段扩增)，它利用端粒酶能在底物DNA末端添加不同数量的序列这一特点，通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。但是传统的TRAP方法为终点电泳检测法，灵敏度低，没法定量，同时还容易产生气溶胶污染。为克服这些缺点，本公司开发了基于探针法qPCR的TRAP试剂盒。

• 即开即用，提供从细胞裂解到qPCR所有试剂，免去自己优化条件。
  
• 基于探针法荧光定量PCR，比电泳法TRAP灵敏度高。
  
• 使用探针，专一性比电泳法TRAP高。
  
• 提供阳性对照，可以进行基于此对照的定量分析。
  
• 一管式操作，免去气溶胶污染之忧。
  
• 既可用于定量，又可用于定性。用于定量时线性范围至少有5个数量级。
  
• 既可用于培养细胞，也可用于实体组织（包括肿瘤组织）。
  
• 本制品足够50次20μL体系的TRAP PCR检测。
  
• 本制品只能用于科研。

首次使用本制品时需要在秀丽隐杆线虫端粒酶底物干粉中加入55μL的超纯水；秀丽隐杆线虫TRAP引物-探针干粉管中加入165μL的超纯水。分别涡旋震荡1分钟溶解，短暂离心后放冰上待用。每次没有用完的需要放-20℃保存。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
   
2. 在1～6号管中加入45μL荧光PCR专用模板稀释液。
   
3. 在6号管中加入5μL 10⁷拷贝/μL的秀丽隐杆线虫TRAP检测阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL 10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线阳性样品。放冰上待用。

• 端粒酶的组成成分中有RNA，极容易被降解，因此，提取端粒酶应该跟提取RNA一样，尽量在低温条件下快速操作、最好使用本公司的固相RNase清除剂预先清洁试验台面等容易有RNase污染的地方。

7. 对冷冻的线虫：将50～100mg在-80℃冷冻的线虫放装有液氮的研钵中研磨成粉末，再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入200μL预冷的TRAP专用细胞裂解液，温和手动匀浆6次后冰浴30分钟，每间隔5分钟涡旋振荡一次，然后直接进入第10步操作。
   
   • 为保证裂解效果，可在显微镜下观察确保大部分细胞已经裂解。如果线虫样品不足50～100mg，可以按比例降低TRAP专用细胞裂解液用量。在-20℃保存的线虫放置2个月后就失去端粒酶活性，而在-80℃保存的线虫放置数年还有端粒酶活性。
8. 对新鲜的培养线虫细胞：用自备的预冷PBS洗涤10⁶个经过胰酶处理的培养线虫细胞或50～100mg经过胰酶处理的新鲜线虫，3000g 4℃离心5分钟，弃上清，细胞沉淀可以直接使用，也可以放-80℃保存后续使用。在细胞沉淀中加入200μL预冷的TRAP专用细胞裂解液，轻柔吹打3次悬浮细胞。对新鲜细胞：涡旋振荡10秒后置冰浴30分钟，每间隔5分钟涡旋振荡一次。对新鲜线虫：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴30分钟，每间隔5分钟涡旋振荡一次。如果细胞不足10⁶或50～100mg，按比例降低TRAP专用细胞裂解液用量。
   
9. 14000g 4℃离心20分钟，收集160μL上清（含端粒酶），留40μL不取。
   
10. 取部分上清液用自备BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。
    
11. 测出各样品的蛋白浓度后，用TRAP专用细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成3μg/μL，然后分装合适的量到离心管中，将实验所需的数量放冰上待用，其余的放80℃长期保存（可存放一年）。此步所得样本称为端粒酶待测样本。
    
12. 对每个样本，一次实验需要两管，一管用于测定端粒酶活性，一管用作该待测样本的热灭活阴性对照。制备方式是每个样本取一管端粒酶待测样本，95℃处理10分钟灭活端粒酶，放冰上待用。没有用完的可放-80℃长期保存（可存放一年）供下次使用。

13. 确定端粒酶待测样本的：为便于比较，每个反应所用的蛋白量总量（或对应的细胞数）必须一样，否则不好进行样本间的比较。
    
14. 设置反应。如果有N个样品，每个样品做1次重复（一般建议作三个重复，此处为表述方便，假设只做1次重复），则需要准备2N+6个反应管。多1倍是因为每个样本都需要一个对应的热灭活阴性对照。另外1个用作探针法TRAP阴性对照，最后5个用于标准曲线样本。按下表设置20μL体系的探针法TRAP：
    

    成分	N个样品管	N个热灭活 阴性对照管	探针法TRAP 阴性对照	标准曲线样品管 (1～6管)
    秀丽隐杆线虫端粒酶底物溶液	各1μL	各1μL	1μL	1μL
    第11步所得N个端粒酶待测样本	各1μL	-	-	-
    第12步所得N个热灭活阴性对照样本	-	各1μL	-	-
    TRAP专用细胞裂解液	-	-	1μL	1μL
    第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	-	-	-	各5μL
    秀丽隐杆线虫TRAP引物-探针混合液	各3μL	各3μL	3μL	3μL
    2×TRAP专用qPCR MasterMix	各10μL	各10μL	10μL	10μL
    超纯水	各5μL	各5μL	5μL	-

15. 吹打混匀后上机进行端粒延伸和PCR扩增，反应参数如下：
    

    过程	温度	时间
    端粒延伸	30℃	30min
    预变性	95℃	5min
    PCR反应 (45个循环)	95℃	15sec
    	57.5℃	15sec
    	72℃	30sec(采集FAM通道，淬灭基团为MGB)

    • 若使用ABI 7500 qPCR仪，复性温度57.5℃需改为48℃。

16. 实验的有效性判断：如果标准曲线样本管的FAM信号结果为阴性（无Ct值，或者大于或等于35），则整个实验无效，不需要分析数据，需要重复实验或跟厂家联系。如果探针法TRAP阴性对照管的FAM信号结果均为阳性（有Ct值小于35），说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。如果标准曲线样本管的FAM信号结果为阳性，探针法TRAP阴性对照管的结果为阴性，则实验有效，可以进入下步分析。
    
17. 标准曲线制作：以5个标准曲线样本浓度的log值为横轴，以阳性对照（FAM通道）的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95。再以待测端粒样品的Ct值从阳性对照的标准曲线上推算出待测端粒酶所合成的端粒重复序列的拷贝数的log值，再有此log值推算出新合成的端粒重复序列拷贝数。由于新合成的端粒DNA重复序列的拷贝数跟端粒酶的活性相关。因此端粒酶活性大小跟测试的Ct呈现反相关，同一次实验所得的Ct值可以用来比较各所测各样本中端粒活性的相对大小。